Abstract ：

生物制氢反应条件温和，易实现，可以在获得氢气的同时缓解环境污染问题。其中光合细菌可以太阳为光源，以农作物秸秆水解液中的还原糖和有机酸为碳源产氢，且对底物转化较为彻底，受到广泛关注。尽管通过反应参数优化可以提高玉米秸秆的还原糖得率，但秸秆水解过程中带来的pH值过低/过高、NH4+生成、颜色加深等抑制光发酵产氢的因素无可避免。本文拟以提高光合细菌利用玉米秸秆水解液产氢性能为关键目标，通过基因修饰的方法提高光合细菌在pH抑制条件下的产氢性能，并通过生物信息学分析pH对光合细菌产氢可能的作用机制，同时探讨pH耐受突变株在其他环境抑制条件下的产氢性能，从而分析比较pH、NH4+及光强对产氢的交互作用。 首先，为了获得高效产氢野生菌，首先从自然水域中分离筛选出一株新型产氢光合细菌Rhodobacter capsulatus JL1，它的最适产氢pH值为6.75-7.0，与模式菌株Rhodobacter capsulatus SB1003相比属于偏酸性的荚膜红细菌；JL1以乙酸和葡萄糖为碳源时的底物转化率分别达到67.5%及46.1%，产氢速率分别达到61.08 ± 7.1 mL•L-1•h-1及124.84 ± 0.63 mL•L-1•h-1；在葡萄糖中添加适量乙酸有利于反应液的pH自稳定性从而提高其产氢量。直接以酸处理玉米秸秆水解液为碳源产氢时，最大产氢量达到180.88 ± 2.63 mL-H2•g-1-秸秆，但与相同浓度模型底物葡萄糖为碳源相比，产氢速率大大降低，这可能是受到秸秆水解液中复杂成分的影响。 接着，为了提高光合细菌在光抑制条件下的产氢性能，基于新分离的光合细菌JL1，通过敲除光合产氢相关基因mopAB及mdtB构建了相应的基因缺失菌株JL11、JL12及JL15。结果发现，mdtB单基因缺失菌株JL12的生长受到严重抑制，不利于产氢；mopAB单基因缺失菌株JL11的产氢也较野生型有所降低；只有双基因突变株JL15的产氢量提高，但产氢速率有所降低。为了验证mdtB缺失对光合细菌的影响，基于实验室分离的另一株野生菌R.sphaeroides HY01构建突变株WM01(mdtB-)，发现突变株色素含量及产氢性能较野生菌并未显著优化，表明细菌基因组中存在的大量调控相关基因在不同菌属间的功能差异较大，并且在抑制环境中表达的几率更高。 其次，为了提高光合细菌R.capsulatus JL1的pH耐受性，构建了趋化性调控基因cheR2缺失的突变株R.capsulatus JL1601，并采用单因素方法探索pH、NH4+及光强对其发酵产氢的影响，结果发现R.capsulatus JL1601 (cheR2-)的最适光发酵产氢pH由野生菌的弱酸性向弱碱性偏移，同时耐铵性也得到了明显的提高。以乙酸丁酸为碳源时，突变株的最大产氢量及产氢速率分别较野生菌提高了36.3%和12.3%。将其用于不同秸秆水解液产氢时发现，酸-酶预处理的秸秆水解液最利于突变株产氢，其氢气产量224.85 ± 5.18 mL-H2•g-1-秸秆较野生菌提高了1.7倍，由于产氢特性的改变，突变株对造纸、制药、印刷等碱性废水的处理也具有一定的潜力。 最后，由于pH耐受性改变会影响细菌的耐铵性，对耐铵机制的研究有助于解释pH对光合细菌的作用途径。在基于野生菌株R. sphaeroides HY01构建的随机突变耐铵菌株库，一株典型突变株HRT16在铵抑制条件下（分别添加0.6，1.2及1.8 mM NH4Cl）的产氢量较野生菌HY01分别提高了2.0%，10.5%及26.8%，相应的产氢速率提升了15.9%，6.2%及46.1%。耐铵突变株HRT16以酸-酶处理的玉米秸秆水解液为底物的产氢量较野生菌提高了约50%，但以水热处理的秸秆为底物时产氢仅增加15.2%。生物信息学分析发现，突变株中插入失活的基因为丙酮酸羧化酶基因pycA，该酶作用的底物丙酮酸是生物体内碳循环与氮循环的交叉点，该酶对光合细菌耐铵性的改变途径可能与耐酸性获得机制相关。 在此研究发现的启示下，为了获得更优的pH耐受性菌株，以Tn5转座子为突变工具，以野生型R. capsulatus JL1为亲本构建耐酸突变菌株库。在初始pH为5.5的光照厌氧条件下，一株典型突变株AT11的实际产氢量达到4546.67 ± 122.2 mL•L-1，较野生菌提高了118.6%。分析发现突变发生在etfA基因，定向突变株JL1401(etfAB-)在初始pH值为5.6及8.0时的产氢量及产氢速率较野生菌具有显著提高，在30%铵浓度的条件下产氢量依然达到2637.14 ± 41.46 mL•L-1（野生菌已不产氢），以酸-酶处理的玉米秸秆水解液为底物的产氢量达到278.8 mL-H2•g-1-秸秆。表明etfAB基因的缺失使得光合细菌的产氢pH范围扩大，耐铵性能也得到一定提升，这些耐受性的提升将有利于光合细菌对不同底物的氢能转化效率。

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光发酵 耐受性调控 生物制氢 玉米秸秆

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Abstract ：

光合细菌在大自然分布广泛，且产氢的反应条件温和，可以利用含糖、酸等有机废物产氢，但是光合细菌的产氢速率较低，这一特性阻止了其产氢工业化进程。暗发酵产氢速率较高，却存在底物利用率低、产氢量少的问题。暗-光混合发酵制氢利用光发酵和暗发酵各自的特点，将两者有机结合起来，可以提高底物转化率和产氢速率。但其又存在产氢体系pH下降较快，进而影响产氢量的问题。因此，本文围绕改善暗-光混合发酵产氢性能，分离一株适合于混合发酵的高效产氢光合细菌，通过单因素法优化其光合产氢过程。其次，将分离出的光合细菌和本实验室已有的高效产氢的暗发酵细菌进行混合培养发酵产氢，使用正交法优化混合发酵产氢，最后以秸秆水解液为底物，对比暗-光混合发酵与光发酵、暗发酵以及暗-光两步法发酵的产氢情况。主要研究内容如下： 从西安护城河中分离出一株高效产氢菌XY02，经16S rDNA测序鉴定其属红长命菌属，因此命名为Rubrivivax gelatinosus XY02。从碳源、温度、pH和光照强度方面，对其光发酵产氢进行了系统的优化，探究其最佳产氢条件。实验结果表明：以40 mmol/L的葡萄糖为底物，温度为33°C，pH为7，光照强度为5000 lux时，产氢最佳为 2232.5±144.5 mL•L-1。该细菌在以葡萄糖为底物时，产氢量最高，丁酸、乳酸和丁二酸次之，利用乙酸产氢效果较差。细菌虽然不能利用木糖和乙醇进行产氢，但可以利用它们生长。红长命细菌在pH为6.5时，相较于pH为7，累积产氢量只下降了0.95%，这说明红长命细菌XY02在偏酸性的环境下也可以较好地进行产氢代谢。根据这一特性，其有可能作为暗-光混合发酵的优势菌种。当光照强度从7000 lux升至9000 lux时，累积产氢量和最大产氢速率并未发生明显变化，这说明7000 lux很有可能是红长命细菌XY02的极限光强。 利用正交法优化光合细菌Rubrivivax gelatinosus XY02和暗发酵细菌C.beijerinckii YA001的混合产氢，设计了四因素四水平的正交试验，并对结果进行了方差分析，可知: 在四因素四水平的正交试验中，影响混合发酵产氢的因素的主次顺序为，初始pH＞暗光比＞磷酸盐强度＞光照强度，并且获得最佳累积产氢量的条件为:暗光混合比为1:1、光强为9000 lux、初始pH为7.5、磷酸盐缓冲液浓度为40 mM，获得最佳产氢速率的条件为：暗光混合比为1:1、光强为3000 lux、初始pH为7.5、磷酸盐缓冲液浓度为40 mM。当光照强度为9000 lux时，获得了最大的产氢量，这是由于暗细菌加剧了光屏蔽效应，光合细菌需要更多的光能去合成ATP，因此增大了获得最大产氢量的光强。当光照强度为3000 lux 时，获得了最高的产氢速率。光照强度较低时，产氢由暗发酵主导，表现为高产氢速率、低产氢量。光照强度较高时，产氢由光发酵主导，表现为高产氢量、低产氢速率。 以秸秆水解液为底物，将光发酵、暗发酵、暗光两步法和混合发酵的产氢情况作对比，得知：混合发酵的累积产氢量相比于暗发酵产氢和光发酵提高了208%和34.1%。同时混合发酵的最大产氢速率，相比于暗发酵和光发酵分别降低了23%和提高了58%。因此，混合发酵产氢可以结合各自的产氢优点，综合提高产氢量和产氢速率。混合发酵的累积产氢量与两步法发酵的相比，虽然并无明显优势，但是无需对暗发酵废液进行处理，总体产氢步骤简洁、成本较为低廉。

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产氢优化 光合细菌 混合发酵 生物制氢

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Abstract ：

暗-光混合发酵制氢有效地结合暗发酵和光发酵的特点，大大降低了产氢成本，提高了底物利用率和产氢效率。其中，光合磷酸化过程是光合细菌合成ATP的主要途径，且ATP合成水平较低是导致其产氢速率较低的重要因素，这限制了其利用暗发酵生成的挥发性脂肪酸（VFAs）产氢，降低了混合发酵的制氢效率。然而，迄今为止几乎没有ATP合成调控与光发酵产氢相关的研究报道。且混合产氢仍停留在以葡萄糖、淀粉等高成本食物原料为底物的阶段，底物转化率较低，这限制了其大规模推广应用。因此，本文围绕改善光合细菌产氢性能和提高混合发酵产氢效率的目标，在深入研究产氢调控机理的基础上，通过基因工程对光合细菌的ATP合成及产氢能量相关的物质代谢途径分别进行调控，显著地提高了光合细菌的产氢性能。在此基础上，构建过表达-多突变光合工程菌，通过细胞固定化法将其应用于低成本的秸秆（Cornstalk, CK）水解液为底物的暗-光混合发酵制氢中，显著地提高了秸秆制氢效率。主要研究内容如下： 为了提高光合细菌的ATP合成量，利用表达质粒对R. sphaeroides（球型红细菌）中F0F1-ATPase（ATP合成酶）的结构基因f0/f1操纵子进行过表达，显著提高了其产氢性能。其中，f1过表达导致ATP含量和固氮酶活性与参照菌株相比分别增加了40.7%和32.3%。经过RT-PCR分析其基因的表达水平，f1过表达仅使f1操纵子表达量提高，却略微降低了f0表达量。经过产氢测试，f1过表达的产氢量和最大产氢速率分别增加了27.8%和20.6%，为光合细菌ATP合成及产氢效率的提高提供了新途径。 接着为了进一步优化F0F1-ATPase的基因表达，将其结构基因atpXF置于不同的启动子控制下，对其编码的b2亚基进行过表达，明显改善了其产氢性能。实验结果显示，puc启动子控制下的过表达菌株ZTHCB 的atpXF、f0和f1基因的表达量与参照菌株相比分别增加了370%、60%和130%。此外，ZTHCB的ATP含量和固氮酶活性分别增加了52.8%和41.0%。ATP含量的增加引起固氮酶活性的提高。经过产氢测试，ZTHCB的产氢量和最大产氢速率分别提高了29.1%和17.1%，进一步揭示了F0F1-ATPase对ATP合成及产氢的影响机理。 其次，为了调控与产氢能量相关的物质代谢途径，提高产氢速率；在R. sphaeroides中构建了抑制与固氮酶竞争还原力的cbbR（CBB循环中的调节酶）、hupSL（吸氢酶）、phaC（PHA合成酶）、mmsA（甲基丙二酸-半醛脱氢酶）及qoxAB（醌酶）基因的相关突变株，从而优化了产氢效率。其中三突变株ZYPRH (phaC-cbbR-hupSL-)的产氢性能优于相关所有的单、双突变菌株，其最大产氢速率达177.0 mL H2L-1h-1，与国内外最优水平相比增加了61%，产氢效率提高十分显著。 优化了暗-光混合发酵的产氢条件。在暗-光混合比1:600、起始pH 7.5、磷酸盐缓冲液50 mM及光强10,000 lux 时，新分离的暗发酵细菌Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌） YA012与R. sphaeroides HY01的混合发酵获得最佳产氢量3.96 mol H2mol-1 glucose。研究表明弱碱性起始pH值和高光强有利于混合发酵产氢，且高浓度的磷酸盐缓冲液有助于减缓pH的下降及增加暗发酵液中乙酸与丁酸的比率，进而提高了产氢效率。 最后，在以上研究基础上，本文构建了高产氢活性过表达-多突变菌株R. sphaeroides ZYTF (phaC-cbbR-hupSL-f1+)，其最大产氢速率为196 mL H2L-1h-1，与国际最优水平相比提高了80%，为进一步发展混合发酵奠定了基础。以葡萄糖（glucose）为底物，牛粪和ZYTF的混合发酵获得高达6.09 mol H2mol-1 glucose的产氢量，显著提高了产氢效率；其与国内外最优结果相比底物转化率提高了22%，更加接近于12 mol H2mol-1glucose的最高理论值。随后，以低成本NaOH-酶预处理的秸秆水解液为底物，牛粪和固定化的ZYTF的混合发酵取得高达426.8 mL H2g-1-CK的产氢量。在产氢速率方面，混合发酵介于单独的暗发酵和光发酵之间。与国内外秸秆发酵产氢水平相比，本文混合发酵的产氢量比暗发酵或光发酵提高了约2倍，且接近两步法发酵最优水平。而由于不需要暗发酵废液的预处理及暗、光发酵2个阶段相匹配，混合发酵成本比两步法降低了约30%，产氢总时间也减少了25%。本文研究结果表明，混合发酵是处理秸秆类农业废弃物的一个有前途的制氢方法，推进了生物制氢的规模化应用进展。

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代谢调控 光合细菌 混合发酵 秸秆 生物制氢

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Abstract ：

光合细菌制氢途径具有底物利用广泛，反应条件温和，底物转化率高等优点，其可以利用小分子有机酸、含糖类有机废水、生物质解聚液及暗发酵废液等，将太阳能转化为氢能，实现废物回收利用、能源供应与环境保护等多重目标。然而，利用光合细菌产氢技术还处于研究阶段，其产氢速率低、铵抑制效应以及暗发酵?光发酵两步法难匹配性是实现工业规模化产氢的主要瓶颈。? 本文围绕提高光合产氢性能的关键科学问题，以利用光合细菌高效转化纤维素生物质解聚液制氢的目标为出发点，通过比较种属学的方法，筛选最优模型菌株。在此基础上，通过基因操纵定向敲除与固氮酶途径竞争电子还原力的途径；通过筛选获得耐铵性调控基因并对其进行操纵，增强其耐氨性能；同时增强固氮酶表达量以进一步提高其产氢性能。从而获得基因改性球形红细菌的突变株库，筛选其中产氢优势菌株，对其高效利用暗发酵废液中的小分子有机挥发酸，以及秸秆解聚液作为底物碳源时的产氢性能进行了优化研究。本文的主要结论如下：? 为提高产氢速率，本文以荚膜红细菌SB1003为模型菌株，在阻断与产氢途径竞争电子的卡尔文循环(CBB)的同时，敲除细胞色素氧化酶ccoNOQP基因，使得固氮酶的表达得到增强，从而提高了突变菌株的产氢性能。突变株Wb301(ccoNOQP-)和W3p03(ccoNOQP-，cbbp-)的产氢得率分别比野生型菌株提高44.8%和36.0%，最大产氢速率分别提高15.9%和41.9%，固氮酶表达量和固氮酶活性均有不同程度的提高。固氮酶的表达量，及固氮酶活性的提高对产氢性能具有正相关作用。 接着，为获得具有更佳基因改造潜力的菌株，本文通过种属比较学和比较基因组学分析，筛选出最佳野生菌株，并构建以固氮酶产氢代谢电子传递链为基础，敲除与固氮酶竞争电子途径，增加固氮酶表达量，及耐铵调控的基因突变菌株库。相关基因包括光响应蛋白耐铵调控基因(spbA)，吸氢酶基因(hupSL)，磷酸核酮糖激酶调节基因(cbbR)，聚羟基丁酸脂合成酶基因(phbC)和细胞色素氧化酶基因(ccoNOQP)。其中有9株单双缺失菌株的产氢得率和最大产氢速率同时得到提高。其中双缺失株WSH10(spbA-，hupSL-)，最大产氢速率比野生型菌株提高74.46%，产氢得率提高32.88%。 耐铵调控研究中，本文证明spbA基因的敲除，可解除固氮酶受铵抑制效应。spbA和hupSL的双敲除对菌株产氢性能的提高具有很好的协同效应。在固氮酶不受铵抑制的条件下，WH04(hupSL-)和WSH10的最大产氢速率达119 mL H2?L-1h-1和141.9 mL H2?L-1h-1。 利用突变菌株库中卡尔文循环阻断株R. sphaeroidesWR02作为亲本，采用转座子高通量筛选耐铵性突变株的方法，获得了三株具有耐铵性高产氢性能的菌株。最大产氢得率分别较野生型菌株提高72.39%，147.19%和156.13%，产氢速率分别较野生型菌株提高56.83%，233.96%，215.29%，其中菌株WRR38最大产氢速率达到100.78 mL H2/L h。并通过解析得到与铵调控相关的三个新基因信息。 对产氢优势菌株，进一步对其产氢性能进行了优化。在黑暗有氧条件下，当接种浓度从10%，到50%(OD/V)梯度增加过程中，WSH10的产氢速率分别比野生型菌株提高了32.65%、48.69%、134.81%、75.63%和79.22%；30%(OD/V)为其最佳接种浓度。光照厌氧无铵条件为其最适预培养条件，在此预培养条件下，突变株WH04最大光能转化效率达到11.43%；最大产氢速率高达212.63 mL H2?L-1h-1，较黑暗有氧预培养条件所获得的最大产氢速率提高232%；WSH10的平均光能转化效率达到4.81%，同比野生型菌株提高38.22%。 最后，本文系统地以基因改造得到优势菌株为研究对象，以秸秆解聚液作为底物碳源，进行了一步法光合产氢的研究，并从底物浓度、C/N比、磷酸盐浓度方面对其作了产氢优化。得出所有菌株的最佳底物浓度均为35 mM还原糖当量，此时野生型和单缺失株WH04，及双缺失株WSH10的底物转化率分别达到29.67%，38.47%和46.16%，两种突变株同比野生型菌株提高了33.03%和55.58%，基因改良菌产氢性能显著优于野生型菌株。进一步研究了三种模型糖化合物和秸秆解聚液作为碳源产氢过程中pH及生物量随时间变化规律。产氢结果表明，以秸秆水解液为底物碳源时，其产氢性能要优于以相同浓度的模型糖化合物时的产氢性能。缺失株WSH10一步法产氢底物转化率达到5.91 mol H2?mol-1还原糖秸秆解聚液，远高于暗发酵一步法转化秸秆解聚液的产氢的底物转化率（2-4mol H2?mol-1已糖），而与暗发酵-光发酵两步法的底物转化率水平相当。将基因改造过的优势菌株应用于光合细菌一步法转化秸秆解聚液产氢，其工艺流程简化，可操控性增强，经济效益显著。

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光合细菌 基因改造 秸秆 耐铵 生物制氢

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Abstract ：

微生物制氢具有条件温和、能在常温常压下进行等优点，主要包括暗发酵和光合发酵制氢两种方法。光合细菌将暗发酵废液降解转化为氢气，形成暗-光两步法制氢技术。暗发酵细菌与光合细菌的混合菌种为菌源制氢形成一步法制氢技术。本研究中采用葡萄糖和高粱秸秆水解液为底物，以分离的暗发酵细菌和经过基因改造的光合细菌为菌源，采用暗-光两步法和暗光混合菌种制氢两种技术。主要研究结论如下： 为了获得高活性的暗发酵细菌，本文分离获得五株暗发酵细菌并对它们的产氢性能进行研究。实验结果表明暗发酵细菌C.beijerinckii YA001以葡萄糖或木糖为底物制氢的产氢量在五株细菌中是最大的。此外，对暗发酵细菌C.beijerinckii YA001以葡萄糖为底物制氢的主要参数，如氮源种类、氮源浓度和产氢液初始pH进行优化。实验结果表明，菌种C.beijerinckii YA001以葡萄糖为底物制氢的最优条件为，以酵母膏为氮源，酵母膏浓度为5g/L，产氢液初始pH为7.25，在最优产氢条件下的产氢量为2.21mol H2/mol-葡萄糖。另外，对菌种C.beijerinckii YA001以高粱秸秆水解液为底物的产氢性能进行研究，产氢量为1010.85±125.17mL H2/L，这说明C.beijerinckii YA001可以很好地利用高粱秸秆水解液为底物制氢。 为了改善光合细菌的产氢性能，构建了一系列光合细菌突变株，并测试了它们的产氢性能。实验结果表明phbc、hupSL和cbbp的单基因突变株的产氢性能优良。对phbc、hupSL和cbbp进行组合突变获得一系列突变株。以丁酸、乙酸为底物NH4-N为0%和30.37%的条件下，考察了突变株的产氢活性。实验结果表明：突变株A010的产氢量在NH4-N为0%和30.37%的情况下均为最大，分别为7477.33±176.24和7050.67±176.24mL H2/L，与野生型HY01相比分别提高了48.67%和98.50%，菌体内剩余还原力量增多可以提高突变株的产氢量及增强菌株的耐铵性。以高粱秸秆水解液为底物及NH4-N为0%和30.37%的条件下，考察了突变株的产氢性能。实验结果表明：NH4-N为0%时突变株A005的产氢量为3700±76.38mL H2/L，比野生型HY01提高了7.42%;NH4-N为30.37%时突变株A010产氢量为3561.11±100.46mL H2/L，比野生型HY01提高了34.95%，在不同产氢条件下，突变株的产氢量和耐铵性与剩余还原力量密切相关。 为了高效地筛选与产氢相关的调控基因和高效突变株，以转座子pRL27为随机突变工具。获得了Rnf转录水平提高的突变株HR017，发现基因transcriptional trgulator,LysR family methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase对Rnf的转录水平起负向调控作用，突变株HR017的产氢量与野生型HY01相比提高了约10.05%。另外，通过此方法获得了耐铵突变株H7003，以丁酸和乙酸为底物NH4-N为30.37、33.4和36.22%时的产氢量分别为4722.22±571.14、4233.33±808.46和2255.56±189.68mL H2/L，与野生型HY01相比分别提高了382.95%、775.86%和2606.67%。基因Adenylate kinase acetyl-coenzyme A synthetase的失活，使Rhodobacter sphaeroides HY01的耐铵性增强。以高粱秸秆水解液为底物且NH4-N为0%和30.37%的条件下，考察了H7003的产氢活性。实验结果表明：NH4-N为0%时H7003的产氢量为3566±259.81mL H2/L，比野生型HY01提高了3.55%。NH4-N为30.37%时H7003的产氢量为3250±57.74mL H2/L，比野生型HY01提高了23.16%。 最后，在上述研究基础上，用暗-光两步法和混合菌种制氢技术以葡萄糖和高粱秸秆水解液为底物制氢。实验结果表明：以葡萄糖为底物的暗-光两步法制氢的总产氢量为7.12mol H2/mol-glucose，比暗发酵提高了222.17%。以高粱秸秆水解液为底物的暗-光两步法制氢的总产氢量为2.89 mol H2/mol-glucose，比暗发酵提高了256.79%。以葡萄糖或高粱秸秆水解液为底物的暗光菌种混合制氢中，产氢量分别为1.17和1.47mol H2/mol-glucose，与暗发酵相比分别提高了59.45%和71.89%。暗-光两步法和暗光混合菌种制氢均有较高的产氢量，两种方法各有优势，本研究为后续研究奠定了基础。

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暗发酵 光发酵 光合细菌 生物制氢

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Abstract ：

微生物发酵制取氢气可以常温常压下进行，过程容易操作控制，是一种有效的易实现的方法。以生物质为原料的生物制氢方法有暗发酵制氢和光发酵制氢法。生物质经过暗发酵处理释放氢气，产生大量小分子酸和醇，暗发酵处理后的生物质中有机物含量高，可通过光发酵继续处理，提高生物质的转化效率，同时降低有机物的排放量。暗发酵和光发酵耦合制氢方法，是一种有效地利用生物质转化氢气的方法。本文以提高秸秆类纤维素转化氢气的效率为出发点，开展了暗-光发酵两步法处理秸秆产氢的研究。由于光发酵产氢的速率较低，本文从自然水体中筛选到了产氢活性较高的沼泽红假单胞菌Rps.palustris W003，通过敲除对光发酵产氢有抑制作用的基因获得了若干突变菌株，提高了产氢速率和底物转化效率；此外本文首次通过敲除与固氮调控相关的基因也获得了产氢速率和底物转化效率都提高的菌株，并获得了对铵盐敏感度降低的菌株。在暗发酵方面，优化了暗发酵产氢的条件，提高了产氢效率。在以上基础上将暗-光发酵反应联合进行产氢测试。 首先，本文分离到了三株光合细菌，考察了其产氢活性。实验结果表明Rps. palustris W003和Rps. palustris W004可以分解乙酸或丁酸产生氢气，Rubrivivax sp. M002可以利用乙酸或丁酸生长，但不能产氢。对于同一株细菌，采用丁酸作为底物产氢效果比用乙酸的产氢效果好。Rps. palustris W003和Rps. palustris W004可以将底物分解得较彻底，COD去除率达到90% 以上，底物转化效率在50% 以上。Rps. palustris W003的产氢活性最高，选作进一步研究的对象。 接着，为了提高产氢效率，本文通过敲除Rps. palustris W003的吸氢酶大亚基hupL，PHB合成酶基因phaC和phbC等，获得了产氢速率和底物转化效率都提高的突变菌株。hupL与phaC基因各自被敲除或者同时被敲除时，都可以有效地提高产氢速率，且对细菌的形态和生长速率没有影响。hupL与phaC缺失的双突变菌株W012利用乙酸丁酸混合酸的产氢速率可以达到52.2 mL/Lh，比野生菌株W003提高了37.4%，底物转化效率为46.0%，比野生型菌株提高了15.3%。首次研究了phaC基因对产氢的影响，结果表明phaC被敲除后，利用丁酸的转化效率提高了13.5%；首次发现phbC基因被敲除后，Rps. palustris W003的突变菌株不能产氢，且在以乙酸和丁酸为底物的培养基里生长缓慢。 其次，为了研究与固氮调控相关基因对Rps. palustris产氢的影响，本文研究了nifA，glnK2，draT2等基因改变后的单突变或多突变菌株利用乙酸丁酸的生长和产氢情况，并比较了各菌株在不同NH4+-N比例条件下的产氢情况。首次通过敲除与固氮调控相关基因获得产氢速率和底物转化效率都提高的菌株，其中draT2- nifA*双突变菌W028的产氢情况最优，最大产氢速度达到49 mL/L h，底物转化效率最高，可达到49.9%，比野生型提高了25.1%。单独敲除glnK2对最大产氢速率、产氢总量和细菌的生长都有负面影响，hupL的敲除可以弥补glnK2缺失所带来的不足，draT2的敲除对最大产氢速率和产氢总量没什么影响，nifA的Q-linker敲除后，对最大产氢速率没什么影响，对产氢总量有贡献。NH4+-N比例越高，越不利于产氢。本文获得了对铵盐敏感度较低的两株细菌W027和W028，当NH4+-N比例增加到76.3% 时，仍能产氢，但底物转化效率不足20%。 在暗发酵产氢方面，本文考察了pH，HRT，温度，底物浓度等，对暗发酵产氢的影响，优化了暗发酵产氢的条件。获得了适合发酵产氢的参数是pH 5.0，HRT 8.34 h，温度 33.5℃，底物浓度14 g&#8226L-1，氢气产率为2.15 mol H2&#8226mol-1 葡萄糖，比不进行优化控制条件下的氢气产率提高了28.7%；最主要的液相产物是乙酸和丁酸，主要的发酵类型是丁酸型发酵。得出了发酵参数对发酵产物的影响，最重要的影响参数是pH值，其次是温度和HRT，影响最小的是底物浓度。 最后，在以上研究基础上，本文展开了暗发酵和光发酵联合起来处理葡萄糖和秸秆产氢的研究，提高了底物的转化效率。两步法处理后，葡萄糖为底物发酵的氢气产率最高达到950.7 mL H2&#8226g-1 葡萄糖，比暗发酵处理提高了2.1倍，秸秆水解液为底物发酵的氢气产率最高达到769.1 mL H2&#8226g-1 秸秆，比暗发酵提高了2.49倍，COD去除率达到90 % 左右，两步法发酵不仅提高了氢气产率，也达到了治污的目的。

Keyword ：

暗发酵光发酵光合细菌秸秆生物制氢

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Abstract ：

能源问题和环境问题是未来人类长久生存所面临的两大难题。随着社会发展、能源需求量增多、国际油价不断上涨、同时利用煤、石油等造成的环境污染等问题，使得寻找新的替代能源成为各国的战略重点之一。 氢气因其密度低，燃烧热值高（甲烷的3倍），在转化为热能或电能时只产生水蒸气，不会产生有毒气体和温室气体，是最清洁的环保能源，特别适用于交通运输，也是航天航空的理想燃料。因此，在21世纪氢能经济所描绘的蓝图中，氢气是未来最理想的终端能源载体，它的实现将会为人类文明带来新的变革。 本论文提出了一种暗光共培养生物制氢模式，不仅从氢气总产量上比单用暗发酵或光发酵提高了3-4倍，而且使发酵液可以达到排放标准，减少了暗发酵液所带来的环境污染，起到了既缓解（或逐步取代化石能源）能源危机又同时具有环保的双重作用。 本实验研究成果主要分下列四部分讨论：第一部分是对光发酵的光源进行了优化；第二部分是研究接种比例、光照强度，初始pH、温度、底物浓度等因素对共培养产氢的影响。第三部分是利用统计学软件对这些因素进行分析，找到最佳的共培养条件；第四部分在最佳条件下，实验得到的底物转化效率与软件得到的预测值进行比较，并对共培养过程中两株菌的数量变化进行监测。实验结果显示，接种比例、初始pH值、底物浓度是对共培养产氢影响最大的三个因素。在最佳共培养条件下，底物转化效率可以达到5.19mol H2/mol glucose。其氢气产量比单用梭菌发酵制氢提高了3-4倍。在共培养过程中，对梭菌和光合细菌的数量变化进行了监测，这对于研究菌株之间的相互做用提供了引导作用，更对生物制氢产业化的实现具有重大的现实意义和工程价值。

Keyword ：

暗发酵 共培养 光发酵 生物制氢

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Abstract ：

随着社会飞速发展，人们生活水平的提高，全社会对能源的需求越来越高。但是，目前的三大化石能源天然气、煤炭和石油即将枯竭，据世界能源专家预测它们分别还可以使用100年、100年和50年，寻找替代能源的任务也迫在眉睫!能源危机和环境污染两大问题，成为目前全世界的焦点问题。然而氢气因其密度低，燃烧热值高（甲烷的3倍），在转化为热能或电能时只产生水蒸气，不会产生有毒气体和温室气体，是最清洁的环保能源，特别适用于交通运输，也是航天航空的理想燃料。因此，在21世纪氢能经济所描绘的蓝图中，氢气是未来最理想的终端能源载体，它的实现将会为人类文明带来新的变革。本论文提出了利用废弃物暗－光耦联两步法生物制氢的模式，并以蔗糖废水和厨余垃圾进行暗－光两步法制氢取得了成功，不仅从氢气总产量上比单用暗发酵或光发酵提高了2-3倍，而且可以使光发酵液直接达标排放，减少了暗发酵液所带来的环境污染，起到了既缓解（或逐步取代化石能源）能源危机又同时具有环保的双重作用。其主要的结论如下：1）通过对不同菌群的筛选和定向优化，建立了一个高效稳定利用废弃物黑暗发酵产氢的优势菌群体系。其产氢优势菌群主要组成为：以需氧或兼性的芽孢杆菌Bacillus licheniformis, Bacillus flexus和 Enterobacter sp，以及专性厌氧的Clostridium perfringens，Bacillus thermoamylovoranshe，Clostridium thermopalmarium，clostridium butyriclum等产氢微生物组成。2）通过利用DGGE、克隆建库、测序相结合的生物手段，揭示了微生物菌群在整个暗发酵产氢过程中的菌群演替变化规律及其组成与产氢功能的关系。这个优势产氢菌群在常温常压的暗发酵产氢初期，主要由需氧或者兼性的Bacillus licheniformis, Bacillus flexus和 Enterobacter sp发酵产氢，其代谢途径主要为乙酸型发酵；但随着厌氧程度的加剧，优势产氢微生物转变为高效产氢耐酸性的Clostridium perfringens，Bacillus thermoamylovoranshe，Clostridium thermopalmarium，clostridium butyriclum等，其发酵代谢的主要途径为丁酸型发酵，此时为产氢高峰期，产氢速率可达550mlH2/L.h.3）在这个暗发酵的优势产氢菌群体系中，分离获得了一株产氢比优势混合菌群产氢量还高出20％的新菌株，经过对该菌株形态特征、生理生化特征及其分子生物学特征的鉴定，该菌系统进化位置为梭菌属的一个新种，命名为Clostridium sp 3-9。它能利用广泛的碳源在宽广的pH值范围（4.5-9.5）发酵产氢，并且其产氢能力是处于目前国际报道纯菌产氢的前列,能实现每克干重厨余垃圾产氢340mlH2.其16S rRNA的基因序列提交于美国GenBank数据库，接受号为EU167913.4）在光发酵产氢体系中，分离获得一株光发酵产氢菌ZX-5,能应用废弃物中常见的22种碳源生长，能利用其中15种碳源光发酵产氢，并且能高效利用有机酸如乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸和苹果酸等高效（65-90%）转化成高纯度的氢气（90-97%）和少量的CO2.5)通过对菌株ZX-5进行形态特征、生理生化及其分子生物学（16S rRNA）和其产氢功能等特征鉴定为光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeriodes）.丁酸是发酵工业废水和暗发酵产氢废液中得主要有机酸，但国际报道的纯菌微生物一般将丁酸转化成氢气的效率只有40-50%,而我们的菌株ZX-5利用丁酸转化成氢气的效率可达70-80%,是目前报道利用丁酸光发酵产氢最好的菌株。该菌株也被申请专利并保存于中国典型培养保藏中心，其16S rRNA提交于美国GenBank数据库,接受号为：EU123535.6)通过暗－光耦联两步法生物制氢，将暗发酵产氢细菌Clostridium sp 3-9或者优势产氢混合菌群利用厨余垃圾或蔗糖废水高效暗发酵产氢产酸，并将其暗发酵废液作为光合细菌ZX-5光发酵的碳源，光合细菌ZX-5充分将暗发酵液中的有机酸或少量碳水化合物高效率的转化氢气和二氧化碳，并且光发酵液可以直接达标排放，不带来环境污染。这样的暗－光耦联两步法生物制氢，不仅实现了将废弃物更加彻底的转化成氢气，其氢气产量比单用任何一种发酵制氢提高2-3倍，并且减少了废弃物或暗发酵液给环境带来的污染，真正实现了将废弃物资源化、能源化和环保化的一体化制氢方式，对缓解国家能源紧缺和环境污染问题具有双重作用，特别对利用废弃物生物制氢产业化的实现具有重大的现实意义和工程价值。

Keyword ：

暗发酵 光发酵 光合细菌 生物制氢 微生物菌落

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