研究背景：长期以来，血管外膜被认为是一层疏松的结缔组织，其主要的功能是为中膜提供营养支持。最新的研究表明，外膜在心血管疾病的发生和发展过程中起着非常重要的作用。在血管损伤的早期阶段，就能发现血管外膜成纤维细胞的凋亡。此外，血管外膜成纤维细胞活化后，还能够合成和释放活性氧、一氧化氮、炎性因子等，并且血管外膜损伤诱发的血管病变明显早于血管内膜引起的病变。从表观遗传学方面研究心血管疾病发生机制及其基因修饰治疗逐渐成为一个新兴的领域。基因序列外的组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是导致心血管疾病的重要因素。Sirtuins是组蛋白去乙酰化酶（histone　deacetylases，HDACs）的第III类，广泛分布在各种组织及细胞中。其中，SIRT1为sirtuins家族7个同源蛋白（SIRT1-SIRT7）之一，是目前研究较为深入的一个成员。SIRT1广泛分布且能够调节各种细胞的生理功能，包括细胞分化、凋亡、增殖、代谢和衰老等。研究表明SIRT1可通过抑制血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的凋亡在心血管疾病中发挥保护作用，但SIRT1与血管外膜成纤维细胞凋亡的关系及其机制尚未见报道。研究已经表明SIRT1通过去乙酰化靶蛋白核因子-κB（nuclear　factor-kappa　B，NF-κB）、p53　and　Ku70而调节细胞的凋亡。转录因子FoxOs也被认为是SIRT1的下游靶蛋白，FoxOs家族有4个亚型：FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，其中FoxO1在血管的形成和发展中起着非常重要的作用。但是FoxO1乙酰化对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响尚不十分清楚。因此，我们研究了SIRT1和FoxO1对血管外膜成纤维细胞凋亡的作用及SIRT1是否通过去乙酰化FoxO1来调控血管外膜成纤维细胞的凋亡。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome　proliferator-activated　receptors，PPARs）是核转录因子，与细胞的代谢、炎症和凋亡等密切相关。研究证实SIRT1通过去乙酰化PPARγ调节脂质代谢，PPARα激活能够调节细胞的凋亡，但PPARα激活对血管外膜成纤维细胞凋亡的作用及与SIRT1的关系尚不十分清楚。研究目的：1.　观察SIRT1对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞凋亡的影响及其相关机制。2.　研究PPARα激动剂非诺贝特对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞凋亡的影响及分子机制，以阐明SIRT1和PPARα在调节细胞凋亡中的相互关系。研究方法：1.　血管外膜成纤维细胞的培养和鉴定　　　　取大鼠的胸主动脉，分离血管外膜，组织块贴壁法培养细胞，有细胞爬出后更换培养液，待细胞生长达到70%～80%融合状态时，用胰酶消化细胞进行传代，第3-7代细胞用于实验。倒置显微镜下观察细胞的形态，用免疫细胞化学染色鉴定细胞。2.　TNF-α对血管外膜成纤维细胞SIRT1表达及移位的影响将第3代培养的血管外膜成纤维细胞分别以不同浓度的TNF-α（0、10、20和40　μg/L）刺激24　h，另一组以TNF-α（20　μg/L）分别刺激0、4、8、12和24　h，western　blot法检测细胞中SIRT1的表达变化。将血管外膜成纤维细胞接种于预置有盖玻片的6孔板内培养，以TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，采用免疫细胞荧光染色检测SIRT1在血管外膜成纤维细胞中定位的变化。为了进一步证实SIRT1定位的变化，以不同浓度的TNF-α（0、10、20和40　μg/L）刺激细胞24　h，分别提取各组细胞的胞浆蛋白和核蛋白，western　blot法检测SIRT1在细胞胞浆和胞核中表达的变化。3.　TNF-α对血管外膜成纤维细胞活性和凋亡的影响分别以不同浓度的TNF-α（0、5、10、20和40　μg/L）刺激血管外膜成纤维细胞24　h，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位的变化。以TNF-α（20　μg/L）刺激细胞24　h，western　blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved　caspase-3的表达变化。4.　SIRT1激活对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响　原代培养血管外膜成纤维细胞，预先1　h加入SIRT1激动剂白藜芦醇（20　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测SIRT1的表达变化，流式细胞仪检测对细胞凋亡率的影响。为了进一步证实SIRT1激活对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响，我们将pCDNA3.1(+)-SIRT1和pcDNA3.1分别转染入血管外膜成纤维细胞中以获得过表达SIRT1的血管外膜成纤维细胞。在转染pCDNA3.1(+)-SIRT1和pcDNA3.1　48　h后，再加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，western　blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved　caspase-3的表达。5.　SIRT1抑制对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响　原代培养血管外膜成纤维细胞，预先1　h加入SIRT1抑制剂尼克酰胺（10　mM）或sirtinol（15　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测SIRT1的表达变化，流式细胞仪检测对细胞凋亡率的影响。SIRT1　siRNA转染血管外膜成纤维细胞48　h后，加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，western　blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved　caspase-3的表达。6.　FoxO1对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响分别以不同浓度的TNF-α（0、10、20和40　μg/L）刺激血管外膜成纤维细胞24　h，另一组以TNF-α（20　μg/L）分别刺激细胞0、4、8、12和24　h，western　blot法检测细胞FoxO1的表达变化。FoxO1　siRNA转染血管外膜成纤维细胞48　h后，加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，western　blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleaved　caspase-3的表达。7.　SIRT1对血管外膜成纤维细胞凋亡影响的相关机制研究原代培养血管外膜成纤维细胞，加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，免疫共沉淀检测SIRT1和FoxO1之间是否存在相互作用，western　blot法检测SIRT1、FoxO1及Ac-FoxO1的表达。运用SIRT1的激动剂白藜芦醇或基因转染技术升高血管外膜成纤维细胞SIRT1的表达，运用基因沉默技术降低细胞SIRT1的表达，然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测FoxO1和Ac-FoxO1的表达。8.　非诺贝特对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞凋亡影响及其作用机制原代培养血管外膜成纤维细胞，预先1　h加入不同浓度的非诺贝特（25、50和100　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞的凋亡率、线粒体膜电位和细胞周期，western　blot法检测cleaved　caspase-3的表达。原代培养血管外膜成纤维细胞，预先1　h加入不同浓度的非诺贝特（25、50和100　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测SIRT1的表达。血管外膜成纤维细胞预先1　h加入非诺贝特（50　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，分别提取胞浆和胞核蛋白，western　blot法检测SIRT1的定位变化。原代培养血管外膜成纤维细胞，运用基因转染技术升高血管外膜成纤维细胞SIRT1的表达或基因沉默技术降低细胞SIRT1的表达，预先1　h加入非诺贝特（50　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。运用基因沉默技术获得FoxO1低表达的血管外膜成纤维细胞，预先1　h加入非诺贝特（50　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。血管外膜成纤维细胞预先1　h加入不同浓度的非诺贝特（25、50和100　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测FoxO1和Ac-FoxO1的表达。预先1　h给予SIRT1低表达的血管外膜成纤维细胞非诺贝特（50　μM），然后加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h，western　blot法检测FoxO1和Ac-FoxO1的表达。原代培养血管外膜成纤维细胞，预先1h加入PPARα通路抑制剂GW6471（1　μM），随后加入非诺贝特（50　μM）作用1　h,　再加入TNF-α（20　μg/L）刺激24　h。western　blot法检测细胞内SIRT1的表达，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。研究结果：1.　血管外膜成纤维细胞的培养和鉴定免疫细胞化学染色显示：血管外膜成纤维细胞呈长梭形或多边形，血管外膜成纤维细胞标志物波形蛋白染色阳性，血管内皮细胞标志物vWF和血管平滑肌细胞标志物肌动蛋白染色阴性，说明培养的细胞中没有被血管内皮细胞和平滑肌细胞污染。2.　TNF-α　对血管外膜成纤维细胞SIRT1表达和移位的影响　Western　blot结果显示：正常血管外膜成纤维细胞中存在SIRT1的表达，TNF-α　能够浓度依赖性地下调血管外膜成纤维细胞中SIRT1的蛋白表达。SIRT1的时效结果表明，与正常组比较，TNF-α（20　μg/L）刺激细胞4　h时，SIRT1的蛋白表达达到最低，随着刺激时间的延长，SIRT1的表达保持恒定。间接免疫荧光结果显示：SIRT1定位于血管外膜成纤维细胞的细胞核中，在TNF-α　（20　μg/L）刺激下，SIRT1从胞核向胞浆移位。Western　blot结果进一步表明，TNF-α浓度依赖性地促进SIRT1从胞核向胞浆移位。3.　TNF-α降低血管外膜成纤维细胞活性和诱导细胞凋亡MTT结果显示：TNF-α能够降低血管外膜成纤维细胞的活性（20和40　μg/L组,　P