研究背景：
卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居于妇科肿瘤的首位。肿瘤细胞的持续存活与转移是造成卵巢癌患者死亡及预后不良的重要原因。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal　transition,　EMT）是肿瘤侵袭转移过程的关键起始步骤。Warburg效应，即有氧糖酵解，是供给肿瘤细胞能量使之存活、增殖的主要能量代谢方式。EMT与Warburg效应对肿瘤的发展起着至关重要的作用，拮抗EMT和Warburg效应对于肿瘤治疗有重要意义。人参皂苷Rg3是提取自红参的活性皂苷单体，分为20(S)-Rg3和20(R)-Rg3两个同型异构体，前期研究显示20(S)-Rg3能够抑制缺氧诱导的卵巢癌细胞EMT，但尚未有研究探讨其在常氧下拮抗卵巢癌细胞EMT及Warburg效应的作用及机制。
近年研究发现，microRNAs（miRs）是肿瘤细胞EMT和Warburg效应的重要调节分子。miRs是一类长度约为22nt的内源性非编码小RNA，广泛存在于真核生物中，能够与靶基因的3’端非翻译区（3’-UTR）结合，降解mRNA、抑制其翻译。miRs与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡、侵袭、转移等方面发挥重要作用。其中，miR-145逆转某些肿瘤细胞EMT并靶向抑制Warburg效应关键酶分子，且在卵巢癌中显著低表达，但miR-145在卵巢癌进展中的作用及机制尚不明确。20(S)-Rg3可否通过影响miRs例如上调miR-145来拮抗卵巢癌细胞EMT和Warburg效应，迄今未有研究报道。
研究目的：
研究人参皂苷20(S)-Rg3拮抗卵巢癌细胞EMT和Warburg效应的作用，并探讨其机制，为确定20(S)-Rg3能否成为卵巢癌临床治疗候选药物提供依据。
研究方法：
1.　以SKOV3和3AO卵巢癌细胞系为研究对象，qRT-PCR及Western　Blot检测20(S)-Rg3处理后E-cadherin、N-cadherin、vimentin等EMT标志物和PKM2、HK2等Warburg效应相关酶的表达水平以及P-STAT3的表达水平变化，同时用qRT-PCR检测miR-145的水平。
2.　将SKOV3及3AO细胞分三组，即单纯转染inhibitor　negative　control（NC组）、转染inhibitor　negative　control同时用20(S)-Rg3处理（NC+20(S)-Rg3组）、转染miR-145　inhibitor同时用20(S)-Rg3处理（miR-145　inhibitor+20(S)-Rg3组），qRT-PCR及Western　Blot检测三组E-cadherin、N-cadherin、vimentin等EMT标志物和PKM2、HK2等Warburg效应相关酶表达水平的变化，利用Transwell小室检测各组细胞体外迁移和侵袭能力的改变，利用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的变化。
3.　将SKOV3和3AO细胞分为两组，即单纯转染mimic　negative　control（NC组）和转染miR-145　mimic（miR-145　mimic组），qRT-PCR及Western　Blot检测各组E-cadherin、N-cadherin和vimentin等EMT标志物以及PKM2、HK2等Warburg效应相关酶的表达水平变化，利用Transwell小室检测各组细胞体外迁移和侵袭能力的改变，利用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的变化。
4.　用生物信息学软件预测miR-145的靶基因，并通过qRT-PCR、Western　Blot和双荧光素酶报告实验验证miR-145对FSCN1、zeb-2和HK2的直接抑制作用；在SKOV3和3AO细胞中过表达FSCN1，检测E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表达变化，利用Transwell小室检测各组细胞体外迁移和侵袭能力的改变。
5.　在用20(S)-Rg3处理的SKOV3和3AO细胞中过表达STAT3，qRT-PCR、Western　Blot检测PKM2及HK2的mRNA和蛋白表达水平的改变，利用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的变化。
6.　将SKOV3细胞转染miR-145慢病毒对照（NC组）及miR-145慢病毒（miR-145-up组），建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，监测裸鼠体重和皮下移植瘤体积的变化；收集皮下瘤组织，免疫组化检测E-cadherin、vimentin、FSCN1、PKM2及HK2的表达水平。同时，建立裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型，观察miR-145对卵巢癌腹腔种植瘤生长以及裸鼠一般情况的影响。
7.　用5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-cdR）处理SKOV3和3AO细胞系后检测miR-145表达水平的改变，生物学软件分析miR-145前体基因启动子区域可能的甲基化位点，利用甲基化特异性PCR（MSP）检测20(S)-Rg3处理后卵巢癌细胞中miR-145前体基因的甲基化水平。
8.　采用qRT-PCR方法检测20(S)-Rg3组和对照组中DNMT家族成员mRNA水平的差异；用Western　Blot方法进一步检测两组细胞中DNMT3A的蛋白表达变化；在卵巢癌SKOV3和3AO细胞系中过表达DNMT3A（miR-145），用qRT-PCR检测miR-145（DNMT3A）的表达改变。通过qRT-PCR及Western　Blot检测NC、NC+20(S)-Rg3、DNMT3A+20(S)-Rg3三组以及NC、NC+DNMT3A、miR-145　mimic+DNMT3A三组中E-cadherin、N-cadherin和vimentin等EMT标志物表达水平以及PKM2、HK2等Warburg效应相关酶表达水平的变化，利用Transwell小室检测各组细胞体外迁移和侵袭能力的改变，利用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的变化。

研究结果：
1.　20(S)-Rg3逆转卵巢癌细胞EMT过程
在SKOV3和3AO细胞中加入20(S)-Rg3后，细胞中上皮性标志物E-cadherin表达增加而间质性标志物N-cadherin和vimentin表达减弱，miR-145表达上调。敲低miR-145的表达水平时可以阻断20(S)-Rg3逆转EMT的作用，并拮抗20(S)-Rg3引起的细胞迁移和侵袭能力的减弱。过表达miR-145可以下调FSCN1及zeb-2的蛋白水平，双荧光素酶报告实验证实miR-145直接靶向调控FSCN1及zeb-2；过表达FSCN1可以逆转miR-145对卵巢癌EMT的阻断作用。
2.　20(S)-Rg3抑制卵巢癌细胞Warburg效应
20(S)-Rg3处理SKOV3和3AO细胞后，细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量均下降，Warburg效应相关酶PKM2及HK2的mRNA及蛋白水平均下调。20(S)-Rg3处理细胞后p-STAT3水平下降，但是总STAT3水平无明显变化。过表达STAT3可以拮抗20(S)-Rg3对Warburg效应的抑制作用。敲低miR-145的表达水平可以逆转20(S)-Rg3对PKM2和HK2的抑制作用，并拮抗20(S)-Rg3引起的葡萄糖消耗量及乳酸生成量减弱的作用。双荧光素酶报告实验证实miR-145直接靶向调控HK2。
3.　体内实验结果
在皮下移植瘤模型中，miR-145-up组的卵巢癌皮下移植瘤体积较对照组明显减小，并且该组裸鼠肿瘤组织中的E-cadherin表达增高，vimentin、FSCN1、PKM2及HK2表达减弱。在腹腔种植瘤模型中，miR-145-up组的卵巢癌种植瘤体积显著小于对照组，且裸鼠的一般状态优于对照组。
4.　20(S)-Rg3通过下调DNMT3A降低　miR-145前体基因的甲基化水平，促进　miR-145的表达，从而抑制卵巢癌细胞EMT及Warburg效应
5-Aza-cdR　处理SKOV3和3AO细胞后，miR-145的表达水平显著增高。20(S)-Rg3处理后卵巢癌细胞中的miR-145前体基因甲基化水平降低，甲基化转移酶　DNMT3A在20(S)-Rg3处理的细胞中表达下调。过表达DNMT3A可以抵消20(S)-Rg3所致的miR-145表达增多，并且可以拮抗20(S)-Rg3对EMT的阻断作用和Warburg效应的抑制作用，同时过表达miR-145可以阻断DNMT3A对EMT和Warburg效应的促进作用。
结论：
1.　20(S)-Rg3通过miR-145/FSCN1及miR-145/zeb-2逆转卵巢癌EMT。
2.　20(S)-Rg3通过P-STAT3/HK2及miR-145/HK2抑制卵巢癌Warburg效应。
3.　20(S)-Rg3通过抑制甲基化转移酶DNMT3A表达，减弱启动子区甲基化对miR-145表达的抑制。
4.　20(S)-Rg3可能成为治疗卵巢癌的天然候选药物。

关　键　词：20(S)-Rg3；上皮-间质转化；Warburg　效应；卵巢癌
论文类型：应用基础