研究背景：
随着居民生活水平的提高及人口老龄化的加速，心血管疾病的发病率持续升高，目前已成为我国死亡率居第一位的疾病。内皮功能障碍是冠心病、动脉粥样硬化和高血压等心血管疾病的始动因素和关键环节。导致内皮功能障碍的病理因素有多种，如高胆固醇、高血糖、高尿酸等。其中胆固醇结晶（cholesterol　crystals，CC）是高浓度的游离胆固醇在血管壁的脂质沉积部位大量堆积，在某些物理或化学因素影响下形成的结晶体。最新研究已证实，微小的胆固醇结晶在高脂血症阶段即可出现在血管壁内膜表面或内膜下，并通过炎症反应、氧化应激和机械划伤等途径损伤巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞等。虽然目前少量研究已证实胆固醇结晶可以损伤内皮细胞，但是胆固醇结晶对内皮细胞形态和功能的影响及其所涉及的机制仍然不是十分清楚。
Sirtuins（SIRT1~SIRT7）是第III类组蛋白去乙酰化酶（histone　deacetylases，HDACs），广泛分布于多种组织和细胞中。SIRT6是Sirtuins家族的成员之一，能够参与调控心血管疾病、癌症、代谢异常等多种疾病的发生发展过程。研究报道发现SIRT6可通过改善糖耐量、抑制甘油三酯合成及内脏脂肪堆积等调节糖脂代谢。本课题组通过前期的体外实验发现，SIRT6可以通过抑制炎症反应对内皮细胞产生保护作用，但是在动物整体水平，内皮细胞中SIRT6特异性缺失是否会影响小鼠的血管内皮功能，同时，SIRT6在胆固醇结晶诱导内皮细胞损伤的过程中发挥着怎样的作用尚不清楚。本研究旨在阐明内皮细胞SIRT6特异性缺失对小鼠血管功能的影响，并进一步研究SIRT6在胆固醇结晶诱导的内皮细胞功能障碍中的调控作用及其机制。
研究目的：
1.　构建内皮细胞SIRT6特异性敲除小鼠（ecSIRT6-/-）及其高脂血症模型，探讨内皮细胞中SIRT6基因缺失对正常及高脂血症小鼠基本表型和血管内皮功能的影响。
2.　研究SIRT6对胆固醇结晶诱导的内皮细胞功能障碍的影响，并进一步探讨SIRT6调控eNOS发挥内皮细胞保护作用的分子机制。
研究方法：
1.　内皮细胞SIRT6特异性敲除对小鼠表型及血管功能的影响
利用Cre-LoxP条件性基因敲除系统，将SIRT6flox/flox小鼠与Tie2-Cre小鼠杂交培育成ecSIRT6-/-小鼠。应用HE染色观察ecSIRT6-/-小鼠各器官是否发生病理学改变；利用硝酸还原酶法检测血清中NO水平及NOS酶活性评价内皮细胞功能；应用Western　blotting法检测小鼠主动脉中eNOS蛋白的表达；应用离体胸主动脉环实验评估小鼠血管舒张功能；应用伊文思蓝染色法检测肺血管内皮通透性。
2.　SIRT6内皮特异性敲除对高脂血症小鼠血管功能的影响
利用高脂饲料饲喂ecSIRT6-/-小鼠及ecSIRT6+/+小鼠12周，成功构建高脂血症小鼠模型，分别记录高脂饲喂4周、8周、12周后的体重及空腹血糖水平；采用直接法或酶法检测小鼠血清中的血脂水平；应用HE染色观察小鼠颈动脉、主动脉及主动脉窦是否出现病理学改变；最后利用硝酸还原酶法检测血清中NO释放水平及NOS酶活性来评估内皮细胞功能。
3.　胆固醇结晶对内皮细胞功能及SIRT6表达定位的影响
体外培养人脐静脉内皮细胞，采用0.5　mg/mL的胆固醇结晶刺激细胞，检测细胞培养液中乳酸脱氢酶释放水平；应用原子力显微镜观察胆固醇结晶对细胞膜表面超微结构的影响；应用免疫荧光观察胆固醇结晶对骨架蛋白F-actin表达的影响；利用内吞抑制剂细胞松弛素D观察并分析进入内皮细胞中胆固醇结晶的荧光量，研究胆固醇结晶是否被内吞进细胞内。利用硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO水平来评估内皮细胞功能，用Western　blotting检测内皮细胞eNOS蛋白的表达。应用Western　blotting及免疫荧光检测内皮细胞SIRT6蛋白的表达及亚细胞定位。
4.　SIRT6参与调控胆固醇结晶诱导的内皮功能障碍
利用腺病毒构建SIRT6人脐静脉内皮高表达，然后加入0.5　mg/mL的胆固醇结晶刺激24　h，Western　blotting检测内皮细胞中eNOS蛋白表达水平。采用胆固醇结晶刺激细胞24　h，利用荧光探针DCFH-DA检测内皮细胞中的ROS水平，Western　blotting检测内皮细胞Nrf2中蛋白表达水平。进一步在内皮细胞高表达SIRT6后应用胆固醇结晶刺激24　h，Western　blotting检测内皮细胞中Nrf2的蛋白表达水平。最后，预先用Nrf2激动剂莱菔硫烷处理细胞，然后再用胆固醇结晶刺激内皮细胞，Western　blotting检测细胞中eNOS的蛋白表达水平。
研究结果：
1.　SIRT6内皮特异性敲除导致小鼠血管内皮功能障碍
我们成功培育出ecSIRT6-/-小鼠。该小鼠的外观、行为等表型均无明显异常；小鼠各器官组织也未见明显的病理学改变。但ecSIRT6-/-小鼠血清中的NO水平及总NOS酶活性显著下降；主动脉中eNOS蛋白表达水平也显著下调；离体胸主动脉环张力检测结果表明内皮细胞中SIRT6的缺失导致小鼠血管内皮依赖性舒张功能受损；伊文思蓝实验结果表明肺血管内皮通透性增加。以上实验结果证明内皮细胞特异性SIRT6基因缺失可导致小鼠血管内皮功能障碍。
2.　内皮细胞中SIRT6基因缺失可加重高脂血症小鼠的血管内皮损伤
与正常饮食的对照组小鼠相比，高脂饲喂的小鼠血脂水平显著升高，表明成功构建了高脂血症小鼠模型。而与高脂血症的ecSIRT6+/+小鼠相比，高脂血症的ecSIRT6-/-小鼠其血糖、血脂水平有所升高，但并无统计学差异。高脂血症的ecSIRT6-/-小鼠主动脉、颈动脉及主动脉窦处并未发现明显的病理学改变。但与高脂血症的ecSIRT6+/+小鼠相比，高脂血症的ecSIRT6-/-小鼠血清中NO水平及总NOS酶活性均显著下降；主动脉eNOS蛋白表达水平显著下调。以上在体实验结果证明，内皮细胞中的SIRT6可能通过调控NO/NOS，而不是通过影响糖脂代谢，发挥保护血管内皮细胞功能的作用。
3.　胆固醇结晶导致内皮细胞功能障碍并下调SIRT6的表达
胆固醇结晶刺激后，内皮细胞的LDH释放水平显著升高，提示胆固醇结晶可使内皮细胞的细胞膜完整性受损。原子力显微镜观察结果发现胆固醇结晶刺激可使细胞膜表面超微结构发生改变，膜表面粗糙度增加，不规则隆起增多，同时有大量凹孔出现。F-actin染色结果表明胆固醇结晶可导致细胞骨架发生改变。给予内吞抑制剂细胞松弛素D后，细胞内的胆固醇结晶含量明显减少。以上实验证明胆固醇结晶可被细胞内吞进细胞内，使内皮细胞形态发生改变。同时发现内皮细胞培养液中NO释放水平显著降低，eNOS的蛋白表达水平也显著下调，表明胆固醇结晶可导致内皮细胞功能障碍。Western　blotting及免疫荧光结果显示，胆固醇结晶刺激可下调内皮细胞中SIRT6蛋白表达，但不影响其亚细胞定位。
4.　SIRT6通过上调Nrf2促进内皮细胞中eNOS的表达
结果显示，胆固醇结晶刺激可下调eNOS的表达，而SIRT6高表达可逆转胆固醇刺激导致内皮细胞eNOS表达的下调。另一方面，胆固醇结晶刺激可下调Nrf2的表达，使细胞内ROS水平升高，而SIRT6高表达可逆转胆固醇刺激导致内皮细胞Nrf2表达的下调。进一步发现Nrf2激动剂可显著上调内皮细胞中eNOS的蛋白表达。以上结果表明，SIRT6可能部分通过促进Nrf2的表达，参与上调内皮细胞中eNOS的表达，进而抑制胆固醇结晶导致的内皮细胞功能障碍。
研究结论：
1.　内皮细胞SIRT6特异性敲除可使小鼠血管舒张功能及屏障功能受损，并可进一步加重高脂血症小鼠的血管内皮功能障碍。
2.　胆固醇结晶被内吞进入细胞内并导致内皮细胞功能障碍，同时下调SIRT6的蛋白表达，但不影响其定位。
3.　SIRT6可上调胆固醇结晶刺激后内皮细胞中eNOS表达，进而保护内皮细胞功能，其作用与增加Nrf2的表达有关。