Abstract:
背景:蠕形螨,分类属蜱螨亚纲,真螨目,肉食螨总科,蠕形螨科,蠕形螨属。自1842年Simon发现以来,目前已知有140种和亚种,分别寄生在犬、牛、羊、猫、猪以及鼠类等11个目哺乳动物的毛囊、皮脂腺、睑板腺、耵聍腺、表皮凹陷、腔道和内脏内,当螨虫大量繁殖时,可引起动物及人蠕形螨病。蠕形螨的分类和种系发生一直依据所寄生的宿主和形态特征。事实上,依据传统的形态特征对蠕形螨的亚种和种内进行鉴定存在很大的困难和不确定性。因此在基因水平鉴定蠕形螨的种系发生关系实为必要。然而,蠕形螨虫源获取和DNA提取困难二大因素直接限制了蠕形螨在分子水平的鉴定和种系发生研究,缺乏蠕形螨在基因水平的研究数据。目的:利用核糖体DNA序列在不同区域进化速度不同这一特征,首次通过序列保守区分段设计通用引物,以获取三种蠕形螨rDNA全序列,然后基于18S rDNA 和28S rDNA对蠕形螨进行系统进化研究,探讨蠕形螨在蜱螨亚纲中的系统进化关系,为最终研究蠕形螨的种群致病性奠定坚实的实验基础。方法:采用透明胶带法自受试者面部获取毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨成虫,采用病灶刮取法获取犬蠕形螨成虫,分类挑取装入EP管;螨虫经过反复冻融研磨后,采用美国OMEGA公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA;利用GenBank已知序列比对获得rDNA保守区通用引物,PCR扩增、克隆和测序;然后用MEGA 4.0软件对蜱螨亚纲4个总科(肉食螨总科、叶螨总科、羽螨总科和蜱总科)的物种进行序列比对分析,并构建系统树;最后以蜜蜂18S和28S rDNA全序列可变区为模板划分蠕形螨序列可变区并进行二级结构预测。结果:获得毛囊蠕形螨rDNA全序列长度为6397bp,皮脂蠕形螨获得了5837bp(缺乏D12区),犬蠕形螨获得了4751bp(缺乏D4-D6和D12区)。一级结构分析可以看出,三种蠕形螨在转录区,18S rDNA最保守,差异百分比均很小,在2.3%-3.8%之间,GC%含量非常接近,在43.4%-43.7%之间;其次为5.8S rDNA和28S rDNA;ITS1和ITS2进化速率最快。因此认为,rDNA各分区由于一级序列差异的不同,可以进行不同阶元分子系统进化的研究。在18S rDNA 和28S rDNA全序列5种进化树中,虽然蜱螨亚纲四个总科各自聚为一支,但总科以上的进化树拓扑结构有所不同。通过计算纳入的蜱螨亚纲4个总科物种的序列长度、差异百分比、转换/颠换、遗传距离以及构建系统树发现,18S rDNA 9个可变区中,除叶螨总科V2、V4和V7出现了明显的序列插入外,其余6个可变区非常保守,认为18S rDNA各可变区均比较适合高阶元总科间/内的物种分类鉴定。V4可变区虽然变异最大,但并不适用于较低阶元(蠕形螨属)的鉴定。相对于18S rDNA,28S rDNA序列差异较大。通过计算纳入的蜱螨亚纲4个总科物种的序列长度、差异百分比、转换/颠换、遗传距离以及构建系统树发现,28S rDNA 13个可变区只能作为蜱螨亚纲四个总科以下较低阶元的分子鉴定和分类,但总科间的鉴别力各不相同。预测的毛囊蠕形螨 rDNA全序列二级结构与已报道的节肢动物主要谱系的结构相一致。在蜱螨亚纲,相对于18S rDNA 62个种株9个可变区二级结构的保守性,预测的28S rDNA 49个种株13个可变区的二级结构在相同的4个总科间差异明显,主要在D2,D3,D5,D7a,D7b,D8和D10区有鉴别价值。结论:首次完成了毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和犬蠕形螨三种蠕形螨的核糖体DNA 18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S近全序列的扩增、克隆、测序和分析;18S rDNA和28S rDNA一级序列在蜱螨亚纲四个总科内的系统进化研究中均具有重要价值,并且28S rDNA可变区在总科阶元以下的鉴别能力要强于18S rDNA可变区;二级分子结构在物种的分子鉴别中更直观,明显优于一级序列比对。
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Degree: 医学博士
Mentor: 徐纪茹
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Year: 2012
Language: Chinese
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