研究背景：
众所周知，动脉粥样硬化属于慢性炎症性疾病，因此调控斑块中炎症的发生发展是有效的治疗策略。细胞自噬作为生物界最基本、最普遍的生物学过程，对于维持心血管功能具有重要作用。研究发现，当促动脉粥样硬化的因素作用于血管内皮细胞、平滑肌细胞或巨噬细胞时会表现出自噬的特征。同时，细胞自噬可通过自噬相关基因或beclin1途径直接或间接地调节炎症的过程，然而，在血管外膜成纤维细胞中是否通过调节自噬进而抑制炎性分子的表达仍不清楚。
Sirtuins是第Ⅲ类尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）依赖性的组蛋白去乙酰化酶，广泛分布于各种细胞和组织中，调控细胞多种生物学过程，如细胞分化、增殖、凋亡、代谢以及衰老。其中SIRT1作为Sirtuins家族7个同源蛋白之一，相较于其他成员研究最为广泛深入。研究表明，SIRT1可诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞自噬，从而对动脉粥样硬化疾病起保护作用。近年来的研究使血管外膜在心血管疾病发生和发展中的作用引起了人们的重视，血管外膜中成纤维细胞的激活不仅诱发动脉粥样硬化疾病的发生，而且会触发血管内膜炎症的发生。但SIRT1与血管外膜成纤维细胞自噬的关系及其潜在机制尚不明确。
越来越多的证据表明SIRT1可通过调节炎症信号通路抑制炎性分子的表达。但是对于SIRT1对血管外膜成纤维细胞内炎性分子的调节作用及其机制未见报道。因此，本研究拟初步观察TNF-α刺激血管外膜成纤维细胞中自噬现象以及对SIRT1表达的影响，并以自噬和SIRT1表达调控的关系为切入点，研究SIRT1在TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞炎症中的作用，再从Akt/mTOR通路深入研究细胞自噬的诱导机制，为治疗动脉粥样硬化疾病提供重要线索。
实验目的：
1.　观察SIRT1对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞自噬的调节作用。
2.　观察SIRT1是否通过Akt/mTOR信号通路调节TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞自噬。
3.　观察SIRT1是否通过自噬调控TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞炎症的发生。
　
实验内容及结果：
1.　SIRT1对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞自噬的调节作用
分别以不同浓度的TNF-α（0、2.5、5、10、20　ng/mL）刺激血管外膜成纤维细胞24　h，MDC染色结果显示：随着TNF-α剂量的增加，自噬泡的数量先增加后减少，且在TNF-α剂量为5　ng/mL和10ng/mL时自噬最为明显。实时定量PCR和Western　blot结果显示：随着TNF-α剂量的增加，LC3Ⅱ/Ⅰ及beclin1的蛋白和mRNA表达从TNF-α剂量为　2.5　ng/mL到10　ng/mL时增加，而20　ng/mL时下降。透射电镜结果显示：5　ng/mL　TNF-α刺激细胞可促进形成胞浆中双层膜结构的自噬体。
分别以不同浓度的TNF-α（0、2.5、5、10、20　ng/mL）刺激血管外膜成纤维细胞24h，实时定量PCR和Western　blot结果显示：低剂量TNF-α（2.5　ng/mL、5　ng/mL）刺激上调SIRT1的蛋白和mRNA表达；而TNF-α（10　ng/mL、20　ng/mL）刺激下调SIRT1蛋白和mRNA表达。此外，SIRT1激动剂白藜芦醇预处理1　h进一步促进TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞中LC3和beclin1的蛋白和mRNA的表达，而SIRT1抑制剂sirtinol以及SIRT1基因沉默则抑制TNF-α诱导的血管外膜细胞自噬的发生。
2.　SIRT1通过Akt/mTOR信号通路调节TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞自噬
分别以不同浓度的TNF-α（0、2.5、5、10、20　ng/mL）刺激血管外膜成纤维细胞24　h，Western　blot结果显示：TNF-α可剂量依赖性地降低血管外膜成纤维细胞中p-Akt蛋白的表达。实时定量PCR和Western　blot结果显示：给予Akt抑制剂MK2206以及mTOR抑制剂雷帕霉素可进一步上调TNF-α诱导的beclin1和LC3的蛋白和mRNA的表达。另外，SIRT1基因沉默可增加血管外膜成纤维细胞中p-Akt蛋白的表达。同时还发现，MK2206可缓解SIRT1基因沉默诱导的beclin1和LC3蛋白以及mRNA水平下调。
3.　SIRT1通过自噬调控TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞炎症
采用IPA软件中的高级分析工具BioProfiler进行分析统计，研究在动脉粥样硬化疾病中细胞自噬、SIRT1以及炎性分子的相互关系，预测结果显示SIRT1与IL-1β为直接相互作用，并且与细胞自噬存在密切联系。
SIRT1基因沉默后TNF-α作用血管外膜成纤维细胞24　h，ELISA法检测炎症因子IL-1β释放，Western　blot法检测炎症小体NLRP3蛋白。结果显示：SIRT1基因沉默可显著增加NLRP3蛋白的表达和IL-1β的分泌。
自噬抑制剂3-MA或自噬激动剂雷帕霉素预处理1　h，TNF-α刺激24　h，结果显示：雷帕霉素可显著抑制TNF-α诱导的NLRP3蛋白的表达和IL-1β的分泌，而3-MA则进一步促进TNF-α诱导的炎症的发生。
结论：
1.　SIRT1促进TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞自噬的表达。
2.　SIRT1通过Akt/mTOR通路促进血管外膜成纤维细胞自噬。
3.　SIRT1抑制TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞的炎症反应，其抑制作用与上调细胞自噬有关。